Embriões de peixe-zebra (Danio rerio)

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Referência : Ribeiro, O. M., Félix, L., Monteiro, S. M., Ribeiro, C., Fontainhas-Fernandes, A., Carrola, J. S., (2024) Embriões de peixe-zebra (Danio rerio), Rev. Ciência Elem., V12(1):003
Autores: Ondina Martins Ribeiro, Luís Félix, Sandra Mariza Monteiro, Cláudia Ribeiro, António Fontainhas-Fernandes e João Soares Carrola
Editor: João Nuno Tavares
DOI: [https://doi.org/10.24927/rce2024.003]
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Resumo

A utilização de modelos animais vertebrados na investigação tem sido fundamental para a compreensão dos processos fisiopatológicos humanos. No entanto, nas últimas duas décadas, a utilização de modelos vertebrados alternativos tem vindo a aumentar, tendo em conta o princípio dos 3 Rs proposto por William Russell e Rex Burch em 1959. Neste sentido, o uso do peixe-zebra (Danio rerio) como modelo na investigação de ciências biomédicas e patologias humanas teve um aumento considerável. De facto, esta espécie apresenta um conjunto de características bioquímicas, fisiológicas, genéticas morfológicas e embriológicas que o tornam um modelo de estudo muito utilizado. Possui um ciclo de vida rápido, reprodução durante todo o ano, fecundidade elevada, e, além disso, o córion é transparente e o embrião semitransparente, o que torna a observação do desenvolvimento embrionário muito fácil usando uma lupa ou microscópio. Acrescem a estas vantagens considerações éticas na avaliação do potencial teratogénico de compostos químicos, como sejam o facto das fases iniciais de vida até às 120 horas após fertilização, não serem consideradas como “animais experimentais”, de acordo com a diretiva da União Europeia 2010/63/EU, transposta para o Decreto-lei 113/2013, respeitante à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos.

Este trabalho pretende fazer uma abordagem geral sobre a utilização do embrião de peixe-zebra como modelo animal para: a) avaliar o potencial teratogénico de compostos; b) analisar algumas das metodologias usadas para avaliação das malformações e c) utilização de diferentes parâmetros como indicadores de toxicidade. São também abordadas as diferentes formas de classificação das malformações e a sua severidade de forma a classificar os compostos químicos como teratogénicos ou não.



Modelos animais na investigação biomédica.

O uso de modelos animais vertebrados na investigação biomédica remonta ao século VI a.C, na Grécia Antiga, para o estudo da anatomia e fisiologia humana. Apesar das grandes descobertas no período inicial da investigação, ainda havia diversos equívocos e lacunas sobre o funcionamento do corpo humano. Só no Renascimento (séculos XIV a XVI) é que os organismos modelo contribuíram para uma verdadeira mudança na compreensão da histologia e fisiologia humana, o que levou à sua utilização até aos dias de hoje[1], [2]

Desde o século passado, estes modelos animais têm vindo a ser utilizados para entender as doenças humanas e os seus mecanismos fisiopatológicos a nível celular e molecular[3], bem como para o desenvolvimento de novos fármacos, vacinas, terapias, entre outros[4].

A investigação biomédica centrou-se muito na utilização de roedores, devido à sua semelhança anatómica, fisiológica, bem como à sua elevada homologia com o genoma humano[5]. Contudo, diversos outros vertebrados podem ser utilizados, tais como anfíbios, peixes, coelhos, cães, incluindo, em situações excecionais, primatas não-humanos.

No entanto, a preocupação crescente com o bem-estar animal veio alterar o panorama da utilização de animais como modelos para investigação e para fins pedagógicos[6]. Esta preocupação remonta já a 1959, quando William Russell e Rex Burch publicaram o livro Os Princípio Humanitário da Técnica Experimental[7], pioneiros na formulação do princípio dos 3 Rs (Replacement, Reduction and Refinement, em português Substituição, Redução e Refinamento). Este princípio é cientificamente aceite e tem sido implementado na legislação mundial relativa à experimentação animal[8], [9] e também na legislação portuguesa, em particular o Decreto-lei 113/2013, respeitante à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos.

Com o aumento da investigação a nível global, registou-se também um incremento no número de animais vertebrados utilizados. No entanto, em consonância com a crescente preocupação com o bem-estar animal, tornou-se necessário desenvolver ensaios e metodologias alternativas considerando a necessidade, viabilidade, ética, potencial dano causado e o retorno da investigação realizada[10]. Essas alternativas incluem ensaios in silico (simulações computacionais) [11] e in vitro (realizados em ambiente controlado de laboratório)[12] contribuindo de forma relevante na substituição e na redução do número de animais utilizados[13].

Nos últimos anos, tem havido um interesse científico crescente em estabelecer organismos modelo alternativos para substituir mamíferos e vertebrados superiores, em conformidade com o já referido princípio dos 3 Rs. Alguns exemplos de organismos modelo alternativos são a mosca- da-fruta (Drosophila melanogaster)[14], o nemátodo terrestre (Caenorhabditis elegans)[15] e o peixe- zebra (Danio rerio)[16], [17], [18], [19]. Esses organismos oferecem oportunidades valiosas, permitindo avanços científicos sem a necessidade de utilizar animais vertebrados de maior complexidade.


Substituição de roedores por Peixe-zebra nos estudos de teratogénese.

A utilização de testes de toxicidade in vivo com roedores tem permitido a avaliação dos efeitos induzidos por tóxicos no seu desenvolvimento embrionário, no entanto, a sua utilização na investigação fundamental e aplicada tem diminuído[20], [21]. Como alternativa, o peixe-zebra tem vindo a ganhar destaque devido à semelhança e conservação dos seus mecanismos moleculares com os mamíferos, durante a organogénese[22]. Adicionalmente, a organogénese da maioria dos órgãos do peixe-zebra é concluída até aos 5 dias após-fertilização, muito mais rápida do que em roedores. Esta rapidez e a comparabilidade dos resultados têm validado o peixe-zebra como um modelo experimental adequado, resultando num aumento considerável da sua utilização em detrimento do rato (Rattus norvegicus) e/ou do murganho (Mus musculus). Adicionalmente, o peixe-zebra oferece uma série de vantagens em relação aos modelos roedores (TABELA 1). Como consequência, este organismo tem vindo a ser crescentemente utilizado para estimar o potencial teratogénico de compostos tóxicos em outros vertebrados e em humanos[23], [24], [25]. Num estudo realizado por Jarque et al.[26], foram testados 31 compostos e os resultados mostraram que o peixe-zebra pode ser utilizado para prever a teratogenicidade em mamíferos, apresentando elevada sensibilidade (94,44%), especificidade (90,91%) e precisão (87,10%), de forma similar aos roedores.

Apesar do peixe-zebra não substituir completamente os roedores como modelo para prever a toxicidade durante o desenvolvimento, é útil para fazer uma estimativa preliminar de teratogenicidade para muitos compostos e é um ótimo modelo em ensaios ecotoxicológicos)[27], [28] , [29] , [30].


TABELA 1. Comparação entre as características do peixe-zebra e roedores[31].


O Peixe-zebra como organismo modelo.

O peixe-zebra emergiu como modelo animal a partir da década de 1980[32], principalmente na área da biologia do desenvolvimento. No entanto, ao longo dos anos, o peixe-zebra tem-se estabelecido como organismo modelo em diversas áreas de investigação, como evidenciado na TABELA 2. A sua versatilidade e características favoráveis têm impulsionado o seu uso em estudos sobre diversos aspetos biológicos e fisiológicos, tornando-o numa ferramenta valiosa para a compreensão dos mecanismos biológicos e a investigação de doenças.


TABELA 2. Áreas de investigação que usam o peixe-zebra como organismo modelo.

D. rerio compartilha muitas características com outras espécies de vertebrados, apresentando um plano corporal básico de cordados, incluindo notocorda, neurocrânio, células da crista neural, estruturas epidérmicas definidas, placódios sensoriais e estruturas neurológicas distintas[33], [34], [35]. Estas semelhanças tornam o peixe-zebra um modelo ideal para estudar uma ampla gama de processos biológicos, desde o desenvolvimento embrionário até à resposta imunológica. Permite ainda fazer a microinjeção celular, uma técnica útil para introduzir tóxicos ou toxinas diretamente no ovo[36], e mimetizando a transferência parental[37] e que pode ser realizada de forma automatizada[38].

Adicionalmente, existem outras vantagens para a utilização desta espécie como organismo modelo na investigação, como detalhado na FIGURA 1 e discutido em estudos anteriores[39], [40].


FIGURA 1. Esquema com as diversas vantagens da utilização do peixe-zebra como organismo modelo, quer como adulto quer na fase de embrião.

O genoma do peixe-zebra foi completamente sequenciado e compartilha elevada homologia genética com os vertebrados superiores, exibindo um grande número de características genéticas comuns a outros vertebrados[41]. Aproximadamente 70% dos genes humanos têm pelo menos um gene ortólogo no peixe-zebra, o que evidencia uma importante semelhança genética entre as duas espécies. Adicionalmente, as vias de desenvolvimento são conservadas entre o peixe-zebra e o ser humano[42], tornando-o particularmente sensível a compostos que podem causar efeitos teratogénicos. Estas características destacam a adequação do peixe-zebra como um modelo experimental para estudar os efeitos de substâncias tóxicas e sua potencial influência no desenvolvimento embrionário.

Apesar das vantagens do peixe-zebra como organismo modelo na investigação serem muitas e aumentarem com o avanço da manipulação genética, também existem algumas limitações/desvantagens ao seu uso e que devem ser consideradas.

O peixe-zebra é ovíparo e os embriões desenvolvem-se externamente, ao contrário dos organismos placentários como os mamíferos[43]. Isto faz com que a exposição aos compostos seja diferente (exposição direta versus indireta), o que pode levar a variações na taxa de absorção, distribuição, metabolização e capacidade de ativação do tóxico no peixe-zebra em comparação com os mamíferos[44]. Adicionalmente, a presença do córion (FIGURA 2) até às 48 ou 72 horas após-fertilização[45] confere uma barreira contra substâncias tóxicas com tamanho molecular superior a 3000 Da, o que pode dificultar a sua entrada e a exposição do embrião. Esta característica pode ser muito útil pois é possível fazer a desinfeção dos ovos antes do início dos ensaios ou antes da sua transferência para outros centros de investigação, permitindo uma melhor segurança sanitária minimizando a transferência de parasitas, bactérias, vírus ou fungos[46], [47].

Esta espécie é evolutivamente mais distante em relação ao Homem do que outros organismos vulgarmente usados como espécies modelo, como por exemplo os roedores[48]. Além disso, não possui alguns órgãos e estruturas comparativamente aos humanos, como por exemplo pulmões, membros, articulações, septo cardíaco, entre outros, o que dificulta a sua utilização em algumas áreas de investigação. Adicionalmente, a determinação sexual do peixe- zebra também difere dos mamíferos, uma vez que esta espécie não possui um cromossoma que define o sexo do organismo e possuem um mecanismo de determinação sexual altamente complexo[49], [50].


FIGURA 2. Estrutura geral do ovo de peixe-zebra, onde se pode observar um invólucro fino e duro (córion) que confere proteção e que pode ser uma barreira para as substâncias tóxicas presentes na água[51].


Teratogénese

A teratologia é a ciência que estuda as alterações nos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de um embrião ou feto, podendo traduzir-se em modificações estruturais (malformações congénitas) nos organismos vivos. Na maioria dos casos pode estar associada à ação de um agente químico (por exemplo, medicamentos, substâncias psicoativas, tóxicos, entre outros) ou físico (por exemplo, radiação). As definições de teratogénese podem incluir alterações bioquímicas, malformações, além de defeitos subtis no comportamento, memória e aprendizagem[52]. Assim, torna-se importante a avaliação dos efeitos teratogénicos que os diversos compostos podem exercer ao longo das primeiras fases de desenvolvimento do peixe-zebra.


Tipos de malformações em embriões de peixe-zebra.

Os ensaios alternativos aos testes de toxicidade de desenvolvimento em animais têm sido desenvolvidos ao longo dos anos, incluindo o teste de embriotoxicidade em peixe-zebra (Zebrafish Embryotoxicity Test – ZET). Em 2013 foram adotadas e validadas as diretrizes da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico (OCDE) para o teste de toxicidade aguda em embriões de peixe (Fish Embryo Acute Toxicity – FET test), o protocolo n.º 236 (OECD, 2013). Este teste encontrou ampla aceitação na comunidade científica como substituto aos ensaios agudos com juvenis e adultos, e até provou ter maior sensibilidade em relação aos seres humanos do que outros organismos modelo[53].

Alguns estudos têm avaliado a importância do uso de peixe-zebra para prever o potencial teratogénico de numerosos compostos tóxicos[54], [55], [56], [57], [58]. Estes estudos focam-se essencialmente em três alterações durante o desenvolvimento anormal do organismo: mortalidade, malformações e atraso no crescimento[59].

No entanto, existe uma elevada variabilidade entre os parâmetros avaliados, bem como uma incoerência na nomenclatura utilizada, o que dificulta a comparação dos resultados entre estudos[60]. Assim, torna-se importante padronizar o sistema de classificação para avaliação do desenvolvimento e malformações dos embriões e larvas de peixe-zebra, de forma a melhorar a reprodutibilidade e a comparação entre os diferentes estudos[61].

Na FIGURA 3, são apresentados exemplos de algumas malformações que podem ser encontradas em larvas de peixe-zebra.


FIGURA 3. Fotografias de larvas de peixe-zebra (D. rerio) com 96 horas após-fertilização (hpf), com desenvolvimento normal. A) Fotografias que mostram larvas com diversas malformações. B) Embrião coagulado. C) Larva com ausência de um olho (ao). D) Larva com curvatura da cauda (escoliose - esc e lordose - lor) e ausência de bexiga natatória (abn). E) Larva com edema no pericárdio (ep) e edema no saco vitelino (esv), esqueleto malformado (em), ausência de cauda (ac). F) Larva com edema no pericárdio (ep) e no saco vitelino (esv), alterações na pigmentação do olho (apo), curvatura da cauda (lordose - lor). G) larva com curvatura da cauda (escoliose - esc). H) Larva com microftalmia (m), malformação na ponta da cauda (mpc), edema do pericárdio (ep) e do saco vitelino (esv).

Na TABELA 3 são apresentadas algumas das metodologias utilizadas em diferentes estudos para a avaliação de malformações e parâmetros específicos em peixe-zebra durante diferentes fases do desenvolvimento embrionário/larval.


TABELA 3. Comparação entre as características do peixe-zebra e roedores.


Classificação da teratogénese dos compostos.

Além da inexistência de padronização do sistema de avaliação dos parâmetros de teratogénese, muitos estudos não consideram a severidade dos efeitos avaliados. De forma a ultrapassar este problema, foi proposto um método quantitativo por Brannen et al. (2010)[62], com a atribuição de uma pontuação de severidade aos diversos parâmetros de peixe-zebra. No entanto, este método foi considerado relativamente trabalhoso e moroso.

Panzica-Kelly et al. (2010)[63] categorizaram cada parâmetro avaliado entre 5 e 0,5 (diminuição do valor com o aumento da severidade da malformação), à exceção do formato do corpo que foi classificado como normal ou anormal. Contudo, esta gradação foi considerada inapropriada para a análise das malformações nas fases iniciais do desenvolvimento de peixe-zebra, uma vez que no início do ensaio o córion dos embriões foi removido. Teixidó et al. (2013)[64] classificaram as características morfológicas entre 1 e 4. O valor de 4 foi atribuído a características desenvolvidas como no período de eclosão, o valor de 3 às características que atingiram o estágio de desenvolvimento do período faríngeo e o valor de 2 para as características que mostram um estágio de desenvolvimento como no período de segmentação. Já o valor de 1 foi atribuído quando as características mostraram uma malformação.

Na gradação utilizada por Padilla et al. (2011)[65] e Padilla et al. (2012)[66] algumas malformações foram classificadas como presentes ou não (sistema binário) enquanto que outras foram pontuadas de acordo com a sua severidade de 0 a 4.

Após a atribuição das pontuações aos diferentes parâmetros, estes valores são utilizados para definir se o composto testado é considerado teratogénico ou não, através de um índice de teratogénese.

De uma forma mais simplista, Padilla et al. (2011)[67] e Padilla et al. (2012)[68] fizeram apenas a soma dos valores de forma a obter um índice de malformações, sem qualquer definição de outros resultados. Quanto maior o valor do índice (máximo de 34) maior a capacidade de o composto induzir malformações.

Ainda assim, os valores de severidade dos diferentes parâmetros foram utilizados de forma a obter o CL50 (concentração calculada do composto resultando em 50% de letalidade/mortalidade) e o CE50 (concentração do composto que induz metade do efeito máximo) para posterior definição do potencial teratogénico de um composto através do índice de teratogénese. Este índice é obtido através do quociente entre CL50/CE50. Um composto com um índice superior a 1 é considerado teratogénico, enquanto que índices inferiores a 1 definem o composto como não teratogénico induzindo maioritariamente efeitos embrioletais/embriotóxicos[69], [70], [71].

A proporção CL50/CE50 é considerada pouco apropriada, uma vez que mesmo que os efeitos sejam observados em pontos de tempo anteriores, se o CL50 e/ou CE50 não forem atingidos no período de exposição, os compostos são automaticamente classificados como não teratogénicos. Desta forma, os estudos de Panzica-Kelly et al. (2010)[72], Hermsen et al. (2011)[73] e Beekhuijzen et al. (2015)[74] definem o CL25 (concentração calculada do composto resultando em 25% de letalidade/mortalidade) e o nível sem efeitos adversos observáveis (NSEAO – do inglês no-observed effect level (NOEL), e obtém o índice de teratogénese através do quociente entre CL25/ NSEAO. Compostos com índice superior a 10 são classificados como teratogénicos enquanto que compostos com índices inferiores a 10 são classificados como não teratogénicos.


Considerações finais.

O peixe-zebra é um modelo animal alternativo e complementar para a substituição do uso de roedores e outros modelos vertebrados, nomeadamente para o estudo de desenvolvimento embrionário. O embrião (semitransparente) é considerado um bom modelo para a avaliação dos potenciais efeitos tóxicos de substâncias teratogénicas, embora apresente diferenças e limitações em relação ao desenvolvimento embrionário dos roedores. Apesar do aumento considerável da sua utilização na investigação do desenvolvimento embrionário, verificou-se uma elevada variação entre os parâmetros avaliados nos diferentes estudo, bem como nomenclaturas diferente para malformações semelhantes. No entanto, o estudo de embriões de D. rerio é importante cumprindo com o princípio Redução/Substituição (é também um alternativa aos testes agudos realizados com juvenis e adultos), com a legislação em vigor (DL: 113/2013) e a preocupação da comunidade em geral, dos organismos e entidades oficiais que regulam e estudam este tema.


Agradecimentos.

Este trabalho é apoiado por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, no âmbito do projeto UIDB/04033/2020 (CITAB/INOV4AGRO) e PTDC/CTA- -AMB/6686/2020 (ENANTIOTOX).

Ondina Ribeiro agradece à FCT pelo financiamento através da bolsa de doutoramento (Ph.D. 2022.12242.BD).

Doação de 30€

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Criada em 2 de Agosto de 2021
Revista em 18 de Janeiro de 2022
Aceite pelo editor em 15 de Abril de 2024

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