O peixe-zebra (Danio rerio) como modelo emergente na ecotoxicologia

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Referência : Ribeiro, O. M., Pinto, M. Q., Félix, L., Monteiro, S. M., Fernandes, A. F., Carrola, J. S., (2022) O peixe-zebra (Danio rerio) como modelo emergente na ecotoxicologia, Rev. Ciência Elem., V10(2):021
Autores: Ondina Martins Ribeiro, Mónica Quelhas Pinto, Luís Félix, Sandra Mariza Monteiro, António Fontaínhas-Fernandes, João Soares Carrola
Editor: João Nuno Tavares
DOI: [https://doi.org/10.24927/rce2022.021]
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Resumo

A libertação de poluentes tradicionais e emergentes nos ecossistemas aquáticos tem levado à contaminação da água e sedimentos, o que pode afetar a saúde dos animais selvagens, das suas populações e contaminar as cadeias alimentares com consequências na ecologia, mas também na saúde pública. Estes diversos compostos tóxicos (incluindo os lipossolúveis e persistentes) podem chegar aos ecossistemas através de diferentes vias e os seus efeitos da exposição aguda e/ou crónica nos organismos não-alvo ainda não são bem compreendidos. Assim, torna-se importante implementar medidas de monitorização da poluição aquática e de estudos ecotoxicológicos usando diversos organismos, desde algas, invertebrados e vertebrados, como por exemplo os peixes, para perceber quais os efeitos dos tóxicos emergentes em vários níveis de organização biológica. O peixe-zebra apresenta numerosas vantagens que o tornaram num modelo vertebrado fundamental, sendo muito utilizado em todo o mundo. Existem numerosos protocolos (desenvolvidos desde 1980), incluindo as Diretrizes 203 da OCDE publicadas a partir de 1992, que permitem avaliar a ecotoxicidade dos contaminantes em amostras de água, efluentes e sedimentos. Desta forma, é possível investigar os efeitos no desenvolvimento (embriogénese/teratogénese), anatomia, biomarcadores (moleculares, bioquímicos, genéticos e histológicos), fisiologia, imunologia, reprodução, comportamento e bioacumulação etc.. Assim, a combinação das análises físico-químicas clássicas e o peixe zebra (embriões, larvas e adultos) pode fornecer informação valiosa do risco potencial dos tóxicos nos ecossistemas aquáticos, mas não devemos esquecer a implementação de testes que sejam ecologicamente relevantes, testes in situ e uso de espécies piscícolas nativas e/ou não tropicais.


A poluição aquática é um problema preocupante à escala mundial, em particular para os ecossistemas de água doce. Um elevado número de compostos químicos de vários tipos, exercem efeitos tóxicos nos organismos aquáticos, contaminando as cadeias alimentares e afetando também os vários usos da água, como por exemplo irrigação na agricultura, recreação e água potável destinada ao consumo humano[1].

As análises químicas são indispensáveis para avaliar a contaminação da água, no entanto, é necessário estudar o impacto desses xenobióticos nos vários organismos vivos, de forma a estimar os efeitos ecotoxicológicos mais complexos a médio e longo prazo. Assim, a ecotoxicologia torna-se importante, na medida em que investiga os efeitos dos tóxicos (naturais ou sintéticos) nos microrganismos, na flora e na fauna, nomeadamente nos organismos selvagens e suas populações, comunidades, ecossistemas e biosfera. A ecotoxicologia visa implementar uma abordagem mais integrativa com o estudo da distribuição, destino dos tóxicos, e concentrações dos tóxicos nas cadeias alimentares incluindo a avaliação dos efeitos nocivos nos vários níveis de organização biológica[2], [3]. Para isto, são usadas diferentes metodologias, desde os estudos de campo, mesoscosmos, microcosmos, até estudos mais controlados realizados em laboratório como testes in vitro e in vivo (FIGURA 1)[4], [5], seguindo as diretrizes dos testes da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE/OECD) e Organização Internacional de Normalização (OIN/ISO).


FIGURA 1. Esquema que representa as diferentes abordagens que podem ser utilizadas para estimar ou avaliar os efeitos ecotoxicológicos: estudos in silico usando técnicas computacionais; in vitro usando culturas de células ou embriões transparentes de peixe-zebra, e técnicas in vivo usando diversos organismos vivos como a drosófila, a dáfnia, a minhoca, o peixe-zebra e roedores.

Os testes in silico recorrem à bioinformática e inteligência artificial para estimar, numa primeira fase, os potenciais efeitos tóxicos de novas moléculas/substâncias recorrendo a programas informáticos sofisticados, reduzindo assim o uso de modelos animais.

Os ensaios in vitro correspondem a estudos realizados “fora” dos organismos vivos, em que se utiliza normalmente células, tecidos ou órgãos isolados em condições laboratoriais. Estes ensaios correspondem a um indicador inicial do efeito tóxico e reduzem consideravelmente o uso de modelos animais. Os ensaios in vivo são realizados com modelos animais criados em laboratório para realizar estudos mais específicos e que permitem avaliar a interação entre células, órgãos e sistemas com efeitos dinâmicos muito complexos. São utilizados diferentes organismos vivos[6], com distintas complexidades metabólicas e neurológicas o que permite estudar efeitos farmacológicos[7], neurotóxicos, comportamentais[8], [9], imunotóxicos, genotóxicos[10], oncológicos entre outros.


Bem-estar animal

Atualmente, a utilização de animais vivos deve ser reduzida o mais possível, em particular os animais incluídos na legislação. O uso de modelos animais para experimentação deve ser autorizada pelo Órgão Responsável pelo Bem-Estar dos Animais (ORBEA) da instituição respetiva e pela Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) e deve ser realizada por pessoas devidamente treinadas e com experiência nas espécies utilizadas. Além das autorizações pelos órgãos competentes, estes ensaios devem seguir as diretrizes e legislação em vigor sobre proteção dos animais (Diretiva da União Europeia 2010/63/EU), transcrita para a legislação nacional (Decreto-Lei n.º113/2013), que integra o conceito dos 3Rs — substituição (Replacement), refinamento (Refinement) e redução (Reduction)[11]. É importante definir os human endpoints no início de cada ensaio de forma a minimizar o sofrimento ou dor dos animais cumprindo com a legislação.


Avaliação dos efeitos dos tóxicos

É importante realizar estudos de campo, numa vertente de monitorização e biomonitorização, in loco, para detetar e quantificar a presença de tóxicos no solo, sedimentos, água e nos tecidos dos organismos[12] bem como os efeitos nos organismos terrestres[13], [14] e aquáticos[15], [16]. Pode-se recorrer à recolha de amostras de água, sedimentos e/ou solo para análises físico-químicas. Pode-se ainda recolher amostras de fluidos (sangue ou urina) ou tecidos de animais, de forma a determinar a bioacumulação, bioconcentração (a concentração do tóxico ou toxina no bivalve é muito superior ao valor presentes na água) ou bioamplificação (aumento da concentração dos tóxicos ao longo da cadeia alimentar contribuindo para valor alto nos animais do topo) dos xenobióticos[17], [18].

Complementarmente, em cada organismo podem ser estudados os efeitos dos xenobióticos em diferentes níveis de organização biológica tais como, ao nível molecular, celular, bioquímico, genético, imunológico, histológico, órgão, organismo (reprodução, desenvolvimento e comportamento), população, comunidade, etc. (FIGURA 2).

Os peixes são considerados bons bioindicadores do estado ecológico da água devido à sua importância ecológica (presa/predador), constante exposição aos compostos tóxicos presentes na água, sedimentos e alimentos, e à sua elevada sensibilidade nas fases inicias de vida (ovos, larvas e alevins) e também como fonte alimentar vital para o Homem. Neste caso a ictiofauna é um elemento fundamental na biomonitorização o que permite ter uma perceção mais real do que acontece aos indivíduos e às populações nos ecossistemas onde vivem[19], [20].

Estes estudos são mais complexos tendo em conta as variáveis que afetam o peixe e por isso alguns estudos são complementados em laboratório.

Os estudos em laboratório permitem avaliar de forma controlada os efeitos de compostos tóxicos puros (misturas simples com 2 ou 3 compostos, ou de misturas complexas como efluentes de industrias ou ETARs) e os seus efeitos em diferentes níveis de organização biológica. Neste contexto, existem determinadas espécies de peixes propostas para estudos de toxicologia e ecotoxicologia em laboratório[21], como a truta (Oncorhynchus mykiss), peixe-zebra (Danio rerio), medaka (Oryzias latipes), vairão-de- -cabeça-gorda (Pimephales promelas), o esgana-gata (Gasterosteus aculeatus). Outras espécies podem ser utilizadas como a tilápia (Oreochromis niloticus)[22], <[23] e guppy (Poecilia reticulata)[24].


FIGURA 2. Esquema que mostra os vários níveis de organização biológica que podem ser afetados por contaminantes. Neste caso estão representados os vários níveis de organização biológica em peixes, expostos a tóxicos ou misturas complexas de tóxicos, desde a componente celular, tecido, órgão, organismo, população e comunidade. Esta abordagem pode ser implementada em dáfnias, minhocas, insetos, anfíbios, roedores, aves ou outros organismos que sejam relevantes para os ecossistemas.

Entre as espécies mais pequenas destaca-se claramente D. rerio por ser um modelo animal muito utilizado na maioria dos centros de investigação ligados à ecotoxicologia aquática[25], [26] e às ciências biomédicas[27], [28], [29]. O interesse por esta espécie cresceu imenso nas últimas décadas tal como se pode verificar facilmente pelo número de artigos científicos publicados e atualmente é uma espécie de referência na toxicologia e é muito utilizada na ecotoxicologia. É de realçar que é importante realizar também testes com organismos endémicos de maneira a entender de forma mais realista quais os efeitos reais para estas espécies nativas o que pode afetar as cadeias alimentares e os ecossistemas contaminados.


O peixe-zebra como modelo nos estudos ecotoxicológicos

D. rerio, ao longo dos anos, tem sido muito utilizado em diversas áreas de investigação como na genética, ecotoxicologia, toxicologia, biologia do desenvolvimento, teratologia, biomedicina, etologia e carcinogénese, entre outros, tornando-se assim num dos organismos modelo mais utilizados[30], [31].

Devido à importância da utilização do peixe-zebra no estudo da poluição aquática foram desenvolvidas diretrizes/protocolos tanto pela OCDE, como pela Organização Internacional de Padronização (ISO). Foram elaborados protocolos pela OCDE para avaliar a toxicidade aguda dos compostos químicos — Ensaio 203[32] e Ensaio 210[33], crescimento — Ensaio 215<[34] e para avaliar os efeitos a curto prazo nos estágios iniciais de vida — Ensaios 212[35]. Em 2008 foram realizadas modificações e propostas novas diretrizes que incluem parâmetros mais sofisticados para a avaliação da ecotoxicidade, que dão mais importância ao modo de ação específico dos compostos ou para estudos completos do ciclo de vida — Ensaio 95[36]. Já a ISO criou diretivas para determinar a toxicidade aguda de águas residuais em ovos de peixe-zebra (Danio rerio) — ISO 15088, determinar a toxicidade para embriões e larvas de peixes de água doce — ISO 12890, determinar a toxicidade letal aguda de substâncias em peixes de água doce (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)) — ISO 7346 e avaliar a toxicidade de nanomateriais em embriões de peixe-zebra dechorionados — ISO 22082.

Durante os primeiros estágios de vida do peixe-zebra (5 dpf — dias após fertilização), a sua utilização na investigação não está abrangida pelas diretrizes de ética e bem-estar animal. Sendo considerado uma alternativa aos ensaios em mamíferos[37], como método de substituição ou refinamento[38]. Apesar do peixe-zebra ser muito diferente morfologicamente do homem, compartilha uma variedade de genes e vias evolutivamente conservadas com outros vertebrados e possui 70% do genoma semelhante ao do Homem[39]. A sua vasta e intensa utilização nas várias linhas de investigação deve-se a um conjunto de vantagens, como explicado na TABELA 1.

Apesar das vantagens da utilização do peixe-zebra como organismo modelo para avaliar os efeitos dos compostos tóxicos, também existem algumas limitações ao seu uso. Por exemplo, é muito distante dos humanos do que outros modelos animais, como roedores, uma vez que o último ancestral comum foi há 445 milhões de anos. Como não é um mamífero, não é possível controlar totalmente a dose química absorvida, uma vez que os embriões não se desenvolvem dentro da placenta[40], e a presença do córion até às 48 hpf dificulta a administração dos compostos. Não possui alguns órgãos comparativamente ao Homem como pulmões, membros, septo cardíaco, articulações, osso esponjoso, entre outros[41]. Além disso, pode ocorrer a duplicação do genoma, ou seja, muitos genes apresentam duas cópias sendo mais difícil determinar papéis funcionais[42].


TABELA 1. Vantagens da utilização do peixe-zebra como modelo animal na investigação.


Biologia do peixe-zebra

D. rerio[43] é um peixe teleósteo tropical de água doce pertence à família Cyprinidae e é originário do Sul da Ásia. Esta espécie foi proposta como organismo modelo em 1983 por George Streisinger, principalmente para a realização de estudos genéticos e de desenvolvimento embrionário[44].

Apresenta um corpo fusiforme, boca superior e uma cabeça curta, variando o seu comprimento total entre 4 a 5 cm[45]. Tem 5 riscas horizontais azul-escuras e/ou prateadas que se estendem até à barbatana caudal, estando também presentes na barbatana anal. A sua coloração pode ser alterada como uma forma de proteção contra os predadores, como resposta a estímulos visuais ou em situações de stresse[46].

Este peixe teleósteo é poiquilotérmico, preferindo temperaturas entre os 26 e os 28 oC, valores ótimos para a sua manutenção e reprodução no biotério. Apresenta um padrão de atividade circadiano semelhante aos mamíferos, estando ativo durante o dia. No seu habitat natural, alimenta-se essencialmente de fitoplâncton, zooplâncton e invertebrados[47] e no biotério é alimentado com granulado ou flocos em função da idade podendo ser administrado alimento vivo como os náuplios de artémia (Artemia salina).


Reprodução e ciclo de vida

O peixe-zebra possui um ciclo de vida relativamente curto (atinge a maturidade sexual entre os 3 e os 6 meses de vida no biotério), assíncrono e a reprodução ocorre durante todo o ano[48] o que permite a obtenção de ovos em qualquer época. Os ovos são semitransparentes (e não aderentes), o que permite estudar facilmente o rápido desenvolvimento embrionário (usando apenas uma lupa) que dura cerca de 3-4 dpf, dependendo da temperatura da água. É um peixe gregário, ou seja, vive em cardume com 5 a 20 peixes na natureza, o que lhe confere proteção contra predadores e facilita a reprodução[49]. No biotério esta espécie é mantida em cardumes (enriquecimento ambiental) e tem sido utilizada para estudos de neurocomportamento, aprendizagem, memória, ansiedade/stress mas possibilita também estudar diversas doenças que afetam o homem como os cancros[50].

O dimorfismo sexual é visível após a maturidade sexual e existem 3 características externas distintas (FIGURA 3): as fêmeas apresentam um abdómen mais proeminente porque os ovários são maiores que os testículos; os machos em geral produzem mais pigmentos amarelos que as fêmeas (xantóforos), mais visível na barbatana anal e caudal; e presença de uma papila genital (libertação de gametas) junto da barbatana anal é ligeiramente saliente nas fêmeas[51], [52].


FIGURA 3. Desenhos do peixe-zebra macho e fêmea, ambos adultos com cerca de 5 cm de comprimento e com as 5 riscas horizontais azuis típicas desta espécie. Esta espécie apresenta dimorfismo sexual evidente, a fêmea apresenta maior volume abdominal.

Às primeiras horas do dia e durante o acasalamento, a postura por parte das fêmeas é coordenada com a libertação de esperma, pelos machos, resultando numa rápida fertilização dos ovos que depois tendem a depositar no fundo.

Em laboratório, a reprodução pode ser melhorada recorrendo ao enriquecimento ambiental, e normalmente são colocadas plantas de plástico e berlindes no fundo das caixas de plástico usadas para recolher os ovos fertilizados.

Existem diversas estratégias de reprodução de peixe-zebra em laboratório, sendo as seguintes as mais comuns (A) e B)):

A) Os machos e fêmeas vivem em aquários separados, e quando se quer induzir a reprodução são colocados juntos num mesmo aquário (FIGURA 4). Os reprodutores podem ser colocados juntos ao final dia e a postura ocorre de manhã cedo, às primeiras horas do dia, ou então os reprodutores são colocados juntos ao início da manhã em que se pretende que ocorra a postura, e esta ocorre durante a manhã. Em ambas situações são colocadas caixas de plástico com fundo duplo nos aquários onde se vão juntar os reprodutores. Isto é, a caixa possui um fundo de rede (removível) cujo diâmetro permite deixar passar os ovos, mas impede que os reprodutores os possam comer. Os ovos depositam- se no fundo da caixa o que facilita a recolha de todos os ovos e os reprodutores regressam aos seus aquários.


FIGURA 4. Esquema que mostra uma das estratégias de reprodução de peixe-zebra. 1. Os machos. 2. As fêmeas vivem em aquários separados, e quando se pretende realizar a reprodução, os reprodutores são colocados juntos numa caixa de fundo duplo. 3. Os ovos depois atravessam a rede e depositam na zona inferior.

B) Outra técnica de reprodução consiste em ter os peixes macho e fêmea sempre no mesmo aquário, e não é necessário transferir os reprodutores, o que reduz o stresse. Quando é necessário induzir a reprodução é apenas necessário diminuir o nível da água e inserir a caixa de plástico com fundo duplo. Os ovos quando afundam ficam retidos na caixa inferior (FIGURA 5) para facilitar a recolha e evitar que sejam comidos.


FIGURA 5. Esquema que representa outra estratégia de reprodução. A. Os peixes reprodutores vivem no mesmo aquário. B. Quando é necessário fazer a reprodução coloca-se uma caixa dupla no fundo do aquário para posteriormente que os ovos se depositam-se no fundo da segunda caixa. (Ondina Ribeiro e João Carrola)

Os ovos de peixe-zebra medem cerca de 0,6-0,7 mm de diâmetro e uma fêmea pode produzir até 700 por postura[53]. Dependendo das condições ambientais, principalmente da temperatura e fotoperíodo, a eclosão dos ovos ocorre por volta do 2 dpf para a maioria dos ovos, sendo que ao 3 dpf (FIGURA 6) a eclosão é finalizada[54].


FIGURA 6. Esquema representativo das várias fases do ciclo de vida do peixe-zebra. É possível estudar aspetos importantes do desenvolvimento embrionário sem recorrer a técnicas invasivas pois o ovo desta espécie é transparente.


Desenvolvimento embrionário

O desenvolvimento embrionário do peixe-zebra começa com a formação do zigoto. O ovo permanece nesta fase até 0,75 horas pós fertilização (hpf), momento em que ocorre a primeira clivagem, que caracteriza o início do período de clivagem. Durante este período (0,75 às 2,25 hpf), ocorrem seis clivagens com intervalos de cerca de 15 minutos, e o organismo vai aumentando o seu grau de celularização (2, 4, 8, 16, 32 e 64 células ou blastómeros). A partir da fase de 128 blastómeros, o organismo entra no período de blástula, durante o qual se forma a camada sincicial do vitelo e tem início a epibolia, que se estende até à gastrulação (5,25 hpf).

No período de gástrula a epibolia continua, e ocorrem movimentos morfogenéticos das células, que conduzem à formação das camadas germinativas primárias e do eixo embrionário. Posteriormente, durante o período de segmentação, ocorre a diferenciação morfológica das primeiras células e os primeiros movimentos do corpo. Durante este período também se observa o aparecimento dos esboços primários dos órgãos e o desenvolvimento de sómitos. Após a formação de 26 pares de sómitos (22 hpf), termina o período de segmentação e começa o de faríngula, que se caracteriza pelo aparecimento de uma notocorda bem desenvolvida, dos arcos faríngicos e das barbatanas peitorais, pelo desenvolvimento do cérebro em 5 lobos distintos, circulação de sangue pelo corpo, entre outos. Este período estende-se até às 42 hpf.

Ulteriormente (72 hpf), ocorre a eclosão, durante o qual o embrião se liberta do córion, dando início ao período larvar, no qual o peixe-zebra passa 4 semanas. Durante esta fase, parâmetros como a temperatura, densidade e diferenças individuais, interferem com o desenvolvimento, tornando-se mais difícil a padronização dos estágios larvares[55].

A diferenciação do aparelho reprodutor ocorre mais tarde. Sendo esta uma espécie gonocórica indiferenciada, as gónadas de todos os indivíduos, na fase inicial de maturação, desenvolvem-se como ovários e, só 5 a 7 semanas após a eclosão começa a diferenciação dos testículos em 50% dos indivíduos.


Considerações finais

Apesar de algumas limitações, existem numerosas vantagens associadas à utilização do peixe-zebra (embriões e também animais adultos) como organismo modelo na avaliação ecotoxicológica e também nas ciências biomédicas, para deteção de tóxicos na água, investigação dos mecanismos de ação e efeitos em vários níveis biológicos) o que tem contribuído de forma significativa para o interesse desta espécie bem patente no aumento do número de publicações científicas internacionais.

Por outro lado, o desenvolvimento de linhas transgénicas de peixe-zebra (por exemplo proteínas fluorescentes) permite melhorar o sistema biológico, sendo uma ferramenta ainda mais eficiente para os estudos de ecotoxicologia.

O embrião de peixe-zebra oferece amplas opções para o uso como um organismo complexo e substitui o uso de outros modelos animais como roedores, implementando o princípio dos 3R’s e permite estimar o efeito de tóxicos para as espécies piscícolas nativas e até extrapolar com muita cautela para outros vertebrados incluindo para os humanos quando os mecanismos moleculares ou bioquímicos envolvidos estão bem conservados.

Os poluentes emergentes, como compostos sintéticos industriais, pesticidas, produtos farmacêuticos, medicamentos veterinários e humanos, plásticos, retardantes da chama, substâncias psicoativas, cosméticos etc., são constantemente lançados nos ecossistemas aquáticos e podem afetar a saúde dos animais selvagens, contaminar a água e os peixes, o que pode afetar a saúde humana. É por isso importante monitorizar de forma eficiente, sensível e económica estes compostos tóxicos e sempre que possível implementar medidas legais para reduzir a sua produção e/ou entrada no ambiente para evitar a contaminação da água (limitando os seus usos), dos solos, mas também das cadeias alimentares fundamentais também para a qualidade de vida e saúde do Homem.

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Criada em 2 de Agosto de 2021
Revista em 18 de Janeiro de 2022
Aceite pelo editor em 15 de Junho de 2022

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