Mostrar código-fonte de O peixe-zebra (Danio rerio) como modelo emergente na ecotoxicologia

<span style="font-size:8pt"><b>Referência : </b> Ribeiro, O. M., Pinto, M. Q., Félix, L., Monteiro, S. M., Fernandes, A. F., Carrola, J. S., (2022) ''O peixe-zebra (Danio rerio) como modelo emergente na ecotoxicologia'', [https://rce.casadasciencias.org Rev. Ciência Elem.], V10(2):021
<br>
<span style="font-size:8pt"><b>Autores</b>: <i>Ondina Martins Ribeiro, Mónica Quelhas Pinto, Luís Félix, Sandra Mariza Monteiro, António Fontaínhas-Fernandes, João Soares Carrola </i></span><br>
<span style="font-size:8pt"><span style="font-size:8pt"><b>Editor</b>: <i>[[Usu&aacute;rio:Jntavar|João Nuno Tavares]]</i></span><br>
<span style="font-size:8pt"><b>DOI</b>: <i>[[https://doi.org/10.24927/rce2022.021 https://doi.org/10.24927/rce2022.021]]</i></span><br>
<html><a href="https://rce.casadasciencias.org/rceapp/static/docs/artigos/2022-021.pdf" target="_blank">
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== Resumo ==

A libertação de poluentes tradicionais e emergentes nos ecossistemas aquáticos tem levado à contaminação da água e sedimentos, o que pode afetar a saúde dos animais selvagens, das suas populações e contaminar as cadeias alimentares com consequências na ecologia, mas também na saúde pública. Estes diversos compostos tóxicos (incluindo os lipossolúveis e persistentes) podem chegar aos ecossistemas através de diferentes vias e os seus efeitos da exposição aguda e/ou crónica nos organismos não-alvo ainda não são bem compreendidos. Assim, torna-se importante implementar medidas de monitorização da poluição aquática e de estudos ecotoxicológicos usando diversos organismos, desde algas, invertebrados e vertebrados, como por exemplo os peixes, para perceber quais os efeitos dos tóxicos emergentes em vários níveis de organização biológica. O peixe-zebra apresenta numerosas vantagens que o tornaram num modelo vertebrado fundamental, sendo muito utilizado em todo o mundo. Existem numerosos protocolos (desenvolvidos desde 1980), incluindo as Diretrizes 203 da OCDE publicadas a partir de 1992, que permitem avaliar a ecotoxicidade dos contaminantes em amostras de água, efluentes e sedimentos. Desta forma, é possível investigar os efeitos no desenvolvimento (embriogénese/teratogénese), anatomia, biomarcadores (moleculares, bioquímicos, genéticos e histológicos), fisiologia, imunologia, reprodução, comportamento e bioacumulação etc.. Assim, a combinação das análises físico-químicas clássicas e o peixe zebra (embriões, larvas e adultos) pode fornecer informação valiosa do risco potencial dos tóxicos nos ecossistemas aquáticos, mas não devemos esquecer a implementação de testes que sejam ecologicamente relevantes, testes in situ e uso de espécies piscícolas nativas e/ou não tropicais.



<html>
<p class='mainText'>A poluição aquática é um problema preocupante à escala mundial, em particular para os
ecossistemas de água doce. Um elevado número de compostos químicos de vários tipos, exercem efeitos tóxicos nos organismos aquáticos, contaminando as cadeias alimentares
e afetando também os vários usos da água, como por exemplo irrigação na agricultura,
recreação e água potável destinada ao consumo humano</html><ref><html>BRUDLER, S. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://backend.orbit.dtu.dk/ws/portalfiles/portal/167236241/Accepted_manuscript.pdf">Pollution levels of stormwater discharges and resulting environmental impacts</a></em>, <em>Science of the total
environment</em>, 663, 754-763. 2019.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>As análises químicas são indispensáveis para avaliar a contaminação da água, no entanto,
é necessário estudar o impacto desses xenobióticos nos vários organismos vivos, de forma
a estimar os efeitos ecotoxicológicos mais complexos a médio e longo prazo. Assim, a ecotoxicologia
torna-se importante, na medida em que investiga os efeitos dos tóxicos (naturais
ou sintéticos) nos microrganismos, na flora e na fauna, nomeadamente nos organismos
selvagens e suas populações, comunidades, ecossistemas e biosfera. A ecotoxicologia visa
implementar uma abordagem mais integrativa com o estudo da distribuição, destino dos
tóxicos, e concentrações dos tóxicos nas cadeias alimentares incluindo a avaliação dos efeitos
nocivos nos vários níveis de organização biológica</html><ref><html>VAN DER OOST, R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21782649/">Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review</a></em>, <em>Environmental
toxicology and pharmacology</em>, 13, 57-149. 2003.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>DUTRA COSTA, B. P. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.mdpi.com/2410-3888/5/3/23">Zebrafish Models in Neural and Behavioral Toxicology across the Life Stages</a></em>, <em>Fishes</em>, 5, 23.
2020.</html></ref><html>. Para isto, são usadas diferentes
metodologias, desde os estudos de campo, mesoscosmos, microcosmos, até estudos mais
controlados realizados em laboratório como testes in vitro e in vivo (FIGURA 1)</html><ref><html>ORIAS, F. & PERRODIN, Y.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23545489/">Characterisation of the ecotoxicity of hospital effluents: a review</a></em>, <em>Science of the total
environment</em>, 454, 250-276. 2013.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>ROMANO, S. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.researchgate.net/publication/336997744_Ecotoxicity_genotoxicity_and_oxidative_potential_tests_of_atmospheric_PM10_particles">Ecotoxicity, genotoxicity, and oxidative potential tests of atmospheric PM10 particles</a></em>, <em>Atmospheric
Environment</em>, 117085. 2019.</html></ref><html>, seguindo
as diretrizes dos testes da <em>Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico</em>
(OCDE/OECD) e <em>Organização Internacional de Normalização</em> (OIN/ISO).</p>

<br>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-01.jpg">
</figure>
<center>
<figcaption>FIGURA 1. Esquema que representa as diferentes abordagens que podem ser utilizadas para estimar ou avaliar os efeitos
ecotoxicológicos: estudos <em>in silico</em> usando técnicas computacionais; <em>in vitro</em> usando culturas de células ou embriões
transparentes de peixe-zebra, e técnicas <em>in vivo</em> usando diversos organismos vivos como a drosófila, a dáfnia, a minhoca,
o peixe-zebra e roedores.
</figcaption>
</center>
<br>

  <p class='mainText'>Os testes <em>in silico</em> recorrem à bioinformática e inteligência artificial para estimar, numa
primeira fase, os potenciais efeitos tóxicos de novas moléculas/substâncias recorrendo a
programas informáticos sofisticados, reduzindo assim o uso de modelos animais.</p>

  <p class='mainText'>Os ensaios in vitro correspondem a estudos realizados “fora” dos organismos vivos,
em que se utiliza normalmente células, tecidos ou órgãos isolados em condições laboratoriais.
Estes ensaios correspondem a um indicador inicial do efeito tóxico e reduzem
consideravelmente o uso de modelos animais. Os ensaios <em>in vivo</em> são realizados com modelos
animais criados em laboratório para realizar estudos mais específicos e que permitem
avaliar a interação entre células, órgãos e sistemas com efeitos dinâmicos muito
complexos. São utilizados diferentes organismos vivos</html><ref><html>RIBEIRO, O. M. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2021/044/">A dáfnia como sensor da ecotoxidade</a></em>, <em>Revista de Ciência Elementar</em>, 9, 044. 2021.</html></ref><html>, com distintas complexidades metabólicas
e neurológicas o que permite estudar efeitos farmacológicos</html><ref><html>PÉREZ-PEREIRA, A. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://setac.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/etc.4955">Ketamine and norketamine: enantioresolution and enantioselective aquatic ecotoxicity studies</a></em>, <em>Environmental toxicology and chemistry</em>, 1-11. 2020.</html></ref><html>, neurotóxicos,
comportamentais</html><ref><html>PINTO, M. Q. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.fishmedjournal.sibic.org/FiSHMED.2018.009/">Effect of copper sulphate in the behavior of Mozambique tilapia under different temperatures</a></em>, <em>Fishes in Mediterranean Environments</em>, 3. 2018.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>RIBEIRO, O. <em>et al.</em>,
<em>Effects of venlafaxine on zebrafish larvaebehaviour - preliminary results. Poster presented in VIII
Congresso da Sociedade Ibérica de Ictiologia</em>, Santiago de Compostela, 76. ISSN: 2659-8760. 2020.</html></ref><html>, imunotóxicos, genotóxicos</html><ref><html>RIBEIRO, O. <em>et al.</em>,
<em>Genotoxicity assessment using comet assay in mozambique tilapia under the effect of copper and
temperature - preliminary data</em>, Poster presented in VIIICongresso da Sociedade Ibérica de Ictiologia, Santiago de
Compostela, 77, ISSN: 2659-8760. 2020.</html></ref><html>, oncológicos entre outros.</p>

<br>

  <p class='mainText'><strong>Bem-estar animal</strong></p>

  <p class='mainText'>Atualmente, a utilização de animais vivos deve ser reduzida o mais possível, em particular
os animais incluídos na legislação. O uso de modelos animais para experimentação deve
ser autorizada pelo <em>Órgão Responsável pelo Bem-Estar dos Animais</em> (ORBEA) da instituição
respetiva e pela <em>Direção-Geral de Alimentação e Veterinária</em> (DGAV) e deve ser realizada
por pessoas devidamente treinadas e com experiência nas espécies utilizadas. Além das
autorizações pelos órgãos competentes, estes ensaios devem seguir as diretrizes e legislação
em vigor sobre proteção dos animais (Diretiva da União Europeia 2010/63/EU),
transcrita para a legislação nacional (Decreto-Lei n.º113/2013), que integra o conceito
dos 3Rs — substituição (<em>Replacement</em>), refinamento (<em>Refinement</em>) e redução (<em>Reduction</em>)</html><ref><html>RUSSELL, W. M. S. & BURCH, R. L.,
<em>The principles of humane experimental technique, Methuen</em>, London. 1959.</html></ref><html>.
É importante definir os human endpoints no início de cada ensaio de forma a minimizar o
sofrimento ou dor dos animais cumprindo com a legislação.</p>

<br>

  <p class='mainText'><strong>Avaliação dos efeitos dos tóxicos</strong></p>

  <p class='mainText'>É importante realizar estudos de campo, numa vertente de monitorização e biomonitorização,
<em>in loco</em>, para detetar e quantificar a presença de tóxicos no solo, sedimentos, água e
nos tecidos dos organismos</html><ref><html>VAN DER OOST, R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21782649/">Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review</a></em>, <em>Environmental
toxicology and pharmacology</em>, 13, 57-149. 2003.</html></ref><html> bem como os efeitos nos organismos terrestres</html><ref><html>GOMES, A. R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28598770/">Review of the ecotoxicological effects of emerging contaminants to soil biota</a></em>, <em>Journal of Environmental
Science and Health</em>, 52, 992-1007. 2017.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>RIBEIRO, O. <em>et al.</em>,
<em>Contaminação do solo com fármacos e efeitos nasminhocas</em>, Poster presented in Congresso Ibérico
“Solo e Desenvolvimento Sustentável: Desafios e Soluções”. 2021.</html></ref><html> e aquáticos</html><ref><html>NASSOUR, C. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34426323/">Aquatic ecotoxicology of anticancer drugs: A systematic review</a></em>, <em>Science of the total environment</em>,
800, 149598. 2021.</html></ref><html><sup>,</sup>
</html><ref><html>VO, H. C. & PHAM, M. H.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34226995/">Ecotoxicological effects of microplastics on aquatic organisms: a review</a></em>, <em>Environmental
Science and Pollution Research</em>, 28, 44716-44725. 2021.</html></ref><html>. Pode-se recorrer à recolha de amostras de água, sedimentos e/ou solo para análises
físico-químicas. Pode-se ainda recolher amostras de fluidos (sangue ou urina) ou tecidos
de animais, de forma a determinar a bioacumulação, bioconcentração (a concentração
do tóxico ou toxina no bivalve é muito superior ao valor presentes na água) ou bioamplificação
(aumento da concentração dos tóxicos ao longo da cadeia alimentar contribuindo para
valor alto nos animais do topo) dos xenobióticos</html><ref><html>HUANG, H. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.nature.com/articles/s41598-017-06148-5">Bioaccumulation and biomagnification of short and medium chain polychlorinated paraffins in different species of fish from Liaodong Bay, North China</a></em>, <em>Scientific reports</em>, 1-9. 2017.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>LAVOIE, R. A. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24151937/">Biomagnification of mercury in aquatic food webs: a worldwide meta-analysis</a></em>, <em>Environmental
science & technology</em>, 47, 13385-13394. 2013.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>Complementarmente, em cada organismo podem ser estudados os efeitos dos xenobióticos
em diferentes níveis de organização biológica tais como, ao nível molecular, celular,
bioquímico, genético, imunológico, histológico, órgão, organismo (reprodução, desenvolvimento
e comportamento), população, comunidade, etc. (FIGURA 2).</p>

  <p class='mainText'>Os peixes são considerados bons bioindicadores do estado ecológico da água devido à
sua importância ecológica (presa/predador), constante exposição aos compostos tóxicos
presentes na água, sedimentos e alimentos, e à sua elevada sensibilidade nas fases inicias
de vida (ovos, larvas e alevins) e também como fonte alimentar vital para o Homem.
Neste caso a ictiofauna é um elemento fundamental na biomonitorização o que permite
ter uma perceção mais real do que acontece aos indivíduos e às populações nos ecossistemas
onde vivem</html><ref><html>CARROLA, J. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.researchgate.net/publication/259956608_Frequency_of_micronuclei_and_of_other_nuclear_abnormalities_in_erythrocytes_of_the_grey_mullet_from_the_Mondego_Douro_and_Ave_estuaries-Portugal">Frequency of micronuclei and of other nuclear abnormalities in erythrocytes of the grey mullet from the Mondego, Douro and Ave estuaries—Portugal</a></em>, <em>Environmental Science and Pollution Research</em>, 21, 6057-6068. 2014.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>CARROLA, J. S. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jemt.23260">Uncommon hepatic macrophagic foamy?cell nodules in Iberian barbel (Lucio barbus bocagei Steindachner, 1864) from the Vizela River (Portugal)</a></em>, <em>Microscopy research and technique</em>, 82, 1127-1135. 2019.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>Estes estudos são mais complexos tendo em conta as variáveis que afetam o peixe e
por isso alguns estudos são complementados em laboratório.</p>

  <p class='mainText'>Os estudos em laboratório permitem avaliar de forma controlada os efeitos de compostos
tóxicos puros (misturas simples com 2 ou 3 compostos, ou de misturas complexas
como efluentes de industrias ou ETARs) e os seus efeitos em diferentes níveis
de organização biológica. Neste contexto, existem determinadas espécies de peixes
propostas para estudos de toxicologia e ecotoxicologia em laboratório</html><ref><html>NORRGREN, L.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://actavetscand.biomedcentral.com/articles/10.1186/1751-0147-54-S1-S14">Fish models for ecotoxicology</a></em>, <em>Acta Veterinaria Scandinavica</em>, 54, 14. 2012.</html></ref><html>, como a truta
(<em>Oncorhynchus mykiss</em>), peixe-zebra (<em>Danio rerio</em>), medaka (<em>Oryzias latipes</em>), vairão-de-
-cabeça-gorda (<em>Pimephales promelas</em>), o esgana-gata (<em>Gasterosteus aculeatus</em>). Outras
espécies podem ser utilizadas como a tilápia (<em>Oreochromis niloticus</em>)</html><ref><html>FIGUEIREDO-FERNANDES, A. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.scielo.br/j/pvb/a/8XPJBffS3sKdRPMS8xps6qB/?lang=en">Histopathological changes in liver and gill epithelium of Nile tilapia, Oreochromis niloticus, exposed to waterborne copper</a></em>, <em>Pesquisa Veterinária Brasileira</em>, 27, 103-109. 2007.</html></ref><html><sup>,</sup> <</html><ref><html>PINTO, M. Q. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.fishmedjournal.sibic.org/FiSHMED.2018.009/">Effect of copper sulphate in the behavior of Mozambique tilapia under different temperatures</a></em>, <em>Fishes in Mediterranean Environments</em>, 3. 2018.</html></ref><html> e guppy
(<em>Poecilia reticulata</em>)</html><ref><html>AICH, A. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25674829/">Ecotoxicological assessment of tannery effluent using guppy fish (Poecilia reticulata) as an experimental model: a biomarker study</a></em>, <em>Journal of Toxicology and Environmental Health</em>, 78, 278-286. 2015.</html></ref><html>.</p>

<br>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-02.jpg">
</figure>
<center>
<figcaption>FIGURA 2. Esquema que mostra os vários níveis de organização biológica que podem ser afetados por contaminantes.
Neste caso estão representados os vários níveis de organização biológica em peixes, expostos a tóxicos ou misturas complexas
de tóxicos, desde a componente celular, tecido, órgão, organismo, população e comunidade. Esta abordagem pode
ser implementada em dáfnias, minhocas, insetos, anfíbios, roedores, aves ou outros organismos que sejam relevantes
para os ecossistemas.
</figcaption>
</center>
<br>

  <p class='mainText'>Entre as espécies mais pequenas destaca-se claramente <em>D. rerio</em> por ser um modelo
animal muito utilizado na maioria dos centros de investigação ligados à <em>ecotoxicologia
aquática</em></html><ref><html>FÉLIX, L. M. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29547861/">Ketamine induction of p53-dependent apoptosis and oxidative stress in zebrafish (Danio rerio) embryos</a></em>, <em>Chemosphere</em>, 201, 730-739. 2018.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>VIEIRA, R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32270457/">Toxic effects of a mancozeb-containing commercial formulation at environmental relevant concentrations on zebrafish embryonic development</a></em>, <em>Environmental Science and Pollution Research</em>, 27, 21174-21187. 2020.</html></ref><html> e às ciências biomédicas</html><ref><html>GAUTHIER, P. T. & VIJAYAN, M. M.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.nature.com/articles/s41598-018-20112-x">Nonlinear mixed-modelling discriminates the effect of chemicals and their mixtures on zebrafish behavior</a></em>, <em>Scientific reports</em>, 8, 1-11. 2018.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>SHEN, C. & ZUO, Z.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32970263/">Zebrafish (Danio rerio) as an excellent vertebrate model for the development, reproductive, cardiovascular, and neural and ocular development toxicity study of hazardous chemicals</a></em>, <em>Environmental Science and Pollution
Research</em>, 1-16. 2020.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>WHITE, R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.nature.com/articles/nrc3589">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward</a></em>, <em>Nature reviews Cancer</em>, 13, 624. 2013.</html></ref><html>. O interesse por esta espécie cresceu imenso
nas últimas décadas tal como se pode verificar facilmente pelo número de artigos
científicos publicados e atualmente é uma espécie de referência na toxicologia e é muito
utilizada na ecotoxicologia. É de realçar que é importante realizar também testes com
organismos endémicos de maneira a entender de forma mais realista quais os efeitos
reais para estas espécies nativas o que pode afetar as cadeias alimentares e os ecossistemas
contaminados.</p>

<br>

  <p class='mainText'><strong>O peixe-zebra como modelo nos estudos ecotoxicológicos</strong></p>

  <p class='mainText'><em>D. rerio</em>, ao longo dos anos, tem sido muito utilizado em diversas áreas de investigação
como na genética, ecotoxicologia, toxicologia, biologia do desenvolvimento, teratologia,
biomedicina, etologia e carcinogénese, entre outros, tornando-se assim num dos organismos
modelo mais utilizados</html><ref><html>LAWRENCE, C.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.researchgate.net/publication/222402017_Lawrence_C_The_husbandry_of_zebrafish_Danio_rerio_A_review_Aquaculture_269_1-20">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review</a></em>, <em>Aquaculture</em>, 269, 1-4, 1-20. 2007.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>SANTOS, D. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601530/">Zebrafish early life stages for toxicological screening: insights from molecular and biochemical markers</a></em>, <em>Advances in Molecular Toxicology</em>, 12, 151-179. 2018.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>Devido à importância da utilização do peixe-zebra no estudo da poluição aquática foram
desenvolvidas diretrizes/protocolos tanto pela OCDE, como pela <em>Organização Internacional
de Padronização</em> (ISO). Foram elaborados protocolos pela OCDE para avaliar a
toxicidade aguda dos compostos químicos — Ensaio 203</html><ref><html>OECD,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-203-fish-acute-toxicity-test_9789264069961-en">Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test</a></em>, <em>OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD Publishing</em>, Paris.
2019.</html></ref><html> e Ensaio 210</html><ref><html>OECD,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-210-fish-early-life-stage-toxicity-test_9789264203785-en;jsessionid=dKzGPWnto8wKef4b83rkNSMl.ip-10-240-5-153">Early-Life Stage Toxicity Test</a></em>, <em>OECD Publishing</em>, Paris. 1992.</html></ref><html>, crescimento —
Ensaio 215<</html><ref><html>OECD,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://ebooks.mpdl.mpg.de/ebooks/Record/EB000317395">Test No. 215: Fish, Juvenile Growth Test</a></em>, <em>OECD Guidelines for the Testing of Chemicals</em>, Paris. 2000.</html></ref><html> e para avaliar os efeitos a curto prazo nos estágios iniciais de vida — Ensaios
212</html><ref><html>OECD,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://search.library.smu.edu.sg/discovery/fulldisplay?vid=65SMU_INST:SMU_NUI&docid=alma99105619702601&fromSitemap=1">Test No. 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages</a></em>, <em>OECD Guidelines for the Testing of
Chemicals</em>, Paris. 1998.</html></ref><html>. Em 2008 foram realizadas modificações e propostas novas diretrizes que incluem
parâmetros mais sofisticados para a avaliação da ecotoxicidade, que dão mais importância
ao modo de ação específico dos compostos ou para estudos completos do ciclo de
vida — Ensaio 95</html><ref><html>OECD,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://one.oecd.org/document/ENV/JM/MONO(2008)22/en/pdf">Test No. 95: Detailed Review Paper on Fish Life-Cycle Tests</a></em>, <em>OECD Publishing</em>, Paris. 2008.</html></ref><html>. Já a ISO criou diretivas para determinar a toxicidade aguda de águas
residuais em ovos de peixe-zebra (<em>Danio rerio</em>) — ISO 15088, determinar a toxicidade para
embriões e larvas de peixes de água doce — ISO 12890, determinar a toxicidade letal aguda de substâncias em peixes de água doce (<em>Brachydanio rerio</em> Hamilton-Buchanan
(Teleostei, Cyprinidae)) — ISO 7346 e avaliar a toxicidade de nanomateriais em embriões
de peixe-zebra dechorionados — ISO 22082.</p>

  <p class='mainText'>Durante os primeiros estágios de vida do peixe-zebra (5 dpf — dias após fertilização),
a sua utilização na investigação não está abrangida pelas diretrizes de ética e bem-estar
animal. Sendo considerado uma alternativa aos ensaios em mamíferos</html><ref><html>DOKE, S. K. & DHAWALE, S. C.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1319016413001096">Alternatives to animal testing: A review</a></em>, <em>Saudi Pharmaceutical Journal</em>, 23, 223-229.
2015.</html></ref><html>, como método de
substituição ou refinamento</html><ref><html>LAMMER, E. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19095081/">Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test?</a></em>, <em>Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology</em>, 149, 196-209.
2009.</html></ref><html>. Apesar do peixe-zebra ser muito diferente morfologicamente
do homem, compartilha uma variedade de genes e vias evolutivamente conservadas
com outros vertebrados e possui 70% do genoma semelhante ao do Homem</html><ref><html>HOWE, K. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.nature.com/articles/nature12111">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome</a></em>, <em>Nature</em>, 496,
498. 2013.</html></ref><html>. A
sua vasta e intensa utilização nas várias linhas de investigação deve-se a um conjunto de
vantagens, como explicado na TABELA 1.</p>

  <p class='mainText'>Apesar das vantagens da utilização do peixe-zebra como organismo modelo para avaliar
os efeitos dos compostos tóxicos, também existem algumas limitações ao seu uso.
Por exemplo, é muito distante dos humanos do que outros modelos animais, como roedores,
uma vez que o último ancestral comum foi há 445 milhões de anos. Como não é um
mamífero, não é possível controlar totalmente a dose química absorvida, uma vez que os
embriões não se desenvolvem dentro da placenta</html><ref><html>D’AMORA, M. & GIORDANI, S.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2018.00976/full">The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity</a></em>, <em>Frontiers
in neuroscience</em>, 12, 976. 2018.</html></ref><html>, e a presença do córion até às 48 hpf
dificulta a administração dos compostos. Não possui alguns órgãos comparativamente ao
Homem como pulmões, membros, septo cardíaco, articulações, osso esponjoso, entre outros</html><ref><html>SANTOS, D. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601530/">Zebrafish early life stages for toxicological screening: insights from molecular and biochemical markers</a></em>, <em>Advances in Molecular Toxicology</em>, 12, 151-179. 2018.</html></ref><html>.
Além disso, pode ocorrer a duplicação do genoma, ou seja, muitos genes apresentam
duas cópias sendo mais difícil determinar papéis funcionais</html><ref><html>ALI, S. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21671352/">Zebrafish embryos and larvae: a new generation of disease models and drug screens</a></em>, <em>Birth Defects Research
Part C: Embryo Today: Reviews</em>, 93, 115-133. 2011.</html></ref><html>.</p>

<br>
<center>
<figcaption>TABELA 1. Vantagens da utilização do peixe-zebra como modelo animal na investigação.
</figcaption>
</center>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-t1.jpg">
</figure>

<br>

<br>

  <p class='mainText'><strong>Biologia do peixe-zebra</strong></p>

  <p class='mainText'><em>D. rerio</em></html><ref><html>HAMILTON, F.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.biodiversitylibrary.org/bibliography/6897">An account of the fishes found in the river Ganges and its branches</a></em>, <em>Archibald Constable and Company</em>.
1822.</html></ref><html> é um peixe teleósteo tropical de água doce pertence à família <em>Cyprinidae</em> e é
originário do Sul da Ásia. Esta espécie foi proposta como organismo modelo em 1983 por
George Streisinger, principalmente para a realização de estudos genéticos e de desenvolvimento
embrionário</html><ref><html>STREISINGER, G. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3455686/">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish</a></em>, <em>Genetics</em>, 112, 311-319.
2008.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>Apresenta um corpo fusiforme, boca superior e uma cabeça curta, variando o seu comprimento
total entre 4 a 5 cm</html><ref><html>ARUNACHALAM, M. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23590398/">Natural history of zebrafish (Danio rerio) in India</a></em>, <em>Zebrafish</em>, 10, 1-14. 2013.</html></ref><html>. Tem 5 riscas horizontais azul-escuras e/ou prateadas que
se estendem até à barbatana caudal, estando também presentes na barbatana anal. A sua
coloração pode ser alterada como uma forma de proteção contra os predadores, como
resposta a estímulos visuais ou em situações de stresse</html><ref><html>SPENCE, R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1095-8649.2006.01206.x">The distribution and habitat preferences of the zebrafish in Bangladesh</a></em>, <em>Journal of Fish Biology</em>, 69,
1435-1448. 2006.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>Este peixe teleósteo é poiquilotérmico, preferindo temperaturas entre os 26 e os 28 <sup>o</sup>C,
valores ótimos para a sua manutenção e reprodução no biotério. Apresenta um padrão de
atividade circadiano semelhante aos mamíferos, estando ativo durante o dia. No seu <em>habitat</em>
natural, alimenta-se essencialmente de fitoplâncton, zooplâncton e invertebrados</html><ref><html>MCCLURE, M. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1095-8649.2006.01125.x">Notes on the natural diet and habitat of eight danionin fishes, including the zebrafish Danio rerio</a></em>, <em>Journal of Fish Biology</em>, 69, 553-570. 2006.</html></ref><html> e
no biotério é alimentado com granulado ou flocos em função da idade podendo ser administrado
alimento vivo como os náuplios de artémia (<em>Artemia salina</em>).</p>

<br>

  <p class='mainText'><strong>Reprodução e ciclo de vida</strong></p>

  <p class='mainText'>O peixe-zebra possui um ciclo de vida relativamente curto (atinge a maturidade sexual entre
os 3 e os 6 meses de vida no biotério), assíncrono e a reprodução ocorre durante todo o
ano</html><ref><html>RIBAS, L. & PIFERRER, F.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/raq.12041">The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research</a></em>, <em>Reviews in Aquaculture</em>, 6, 209-240. 2014.</html></ref><html> o que permite a obtenção de ovos em qualquer época. Os ovos são semitransparentes
(e não aderentes), o que permite estudar facilmente o rápido desenvolvimento embrionário
(usando apenas uma lupa) que dura cerca de 3-4 dpf, dependendo da temperatura da
água. É um peixe gregário, ou seja, vive em cardume com 5 a 20 peixes na natureza, o que
lhe confere proteção contra predadores e facilita a reprodução</html><ref><html>PARICHY, D. M.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://elifesciences.org/articles/05635">The natural history of model organisms: Advancing biology through a deeper understanding of zebrafish ecology and evolution</a></em>, <em>Elife 4</em>, e05635. 2015.</html></ref><html>. No biotério esta espécie
é mantida em cardumes (enriquecimento ambiental) e tem sido utilizada para estudos de
neurocomportamento, aprendizagem, memória, ansiedade/<em>stress</em> mas possibilita também
estudar diversas doenças que afetam o homem como os cancros</html><ref><html>STOLETOV, K. & KLEMKE, R.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://www.nature.com/articles/onc200895">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model, Oncogene</a></em>, 27, 4509-4520. 2008.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>O dimorfismo sexual é visível após a maturidade sexual e existem 3 características externas
distintas (FIGURA 3): as fêmeas apresentam um abdómen mais proeminente porque os ovários
são maiores que os testículos; os machos em geral produzem mais pigmentos amarelos que as
fêmeas (xantóforos), mais visível na barbatana anal e caudal; e presença de uma papila genital
(libertação de gametas) junto da barbatana anal é ligeiramente saliente nas fêmeas</html><ref><html>KOSSACK, M. E. & DRAPER, B. W.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30999973/">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio)</a></em>, <em>Current topics in developmental biology</em>, 134, 119-149. 2019.</html></ref><html><sup>,</sup> </html><ref><html>RUHL, N. et al.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19626019/">Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio)</a></em>, <em>Lab animal</em>, 38, 264. 2009.</html></ref><html>.</p>

<br>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-03.jpg">
</figure>
<center>
<figcaption>FIGURA 3. Desenhos do peixe-zebra macho e fêmea, ambos adultos com cerca de 5 cm de comprimento e com as 5
riscas horizontais azuis típicas desta espécie. Esta espécie apresenta dimorfismo sexual evidente, a fêmea apresenta
maior volume abdominal.
</figcaption>
</center>
<br>

  <p class='mainText'>Às primeiras horas do dia e durante o acasalamento, a postura por parte das fêmeas é
coordenada com a libertação de esperma, pelos machos, resultando numa rápida fertilização
dos ovos que depois tendem a depositar no fundo.</p>

  <p class='mainText'>Em laboratório, a reprodução pode ser melhorada recorrendo ao enriquecimento ambiental,
e normalmente são colocadas plantas de plástico e berlindes no fundo das caixas
de plástico usadas para recolher os ovos fertilizados.</p>

  <p class='mainText'>Existem diversas estratégias de reprodução de peixe-zebra em laboratório, sendo as
seguintes as mais comuns (A) e B)):</p>

  <p class='mainText'>A) Os machos e fêmeas vivem em aquários separados, e quando se quer induzir a reprodução
são colocados juntos num mesmo aquário (FIGURA 4). Os reprodutores podem
ser colocados juntos ao final dia e a postura ocorre de manhã cedo, às primeiras horas
do dia, ou então os reprodutores são colocados juntos ao início da manhã em que se
pretende que ocorra a postura, e esta ocorre durante a manhã. Em ambas situações
são colocadas caixas de plástico com fundo duplo nos aquários onde se vão juntar os
reprodutores. Isto é, a caixa possui um fundo de rede (removível) cujo diâmetro permite
deixar passar os ovos, mas impede que os reprodutores os possam comer. Os ovos depositam-
se no fundo da caixa o que facilita a recolha de todos os ovos e os reprodutores
regressam aos seus aquários.</p>

<br>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-04.jpg">
</figure>
<center>
<figcaption>FIGURA 4. Esquema que mostra uma das estratégias de reprodução de peixe-zebra. 1. Os machos. 2. As fêmeas vivem
em aquários separados, e quando se pretende realizar a reprodução, os reprodutores são colocados juntos numa caixa de
fundo duplo. 3. Os ovos depois atravessam a rede e depositam na zona inferior.
</figcaption>
</center>
<br>

  <p class='mainText'>B) Outra técnica de reprodução consiste em ter os peixes macho e fêmea sempre no
mesmo aquário, e não é necessário transferir os reprodutores, o que reduz o stresse.
Quando é necessário induzir a reprodução é apenas necessário diminuir o nível da água
e inserir a caixa de plástico com fundo duplo. Os ovos quando afundam ficam retidos na
caixa inferior (FIGURA 5) para facilitar a recolha e evitar que sejam comidos.</p>

<br>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-05.jpg">
</figure>
<center>
<figcaption>FIGURA 5. Esquema que representa outra estratégia de reprodução. A. Os peixes reprodutores vivem no mesmo aquário.
B. Quando é necessário fazer a reprodução coloca-se uma caixa dupla no fundo do aquário para posteriormente que os
ovos se depositam-se no fundo da segunda caixa. (Ondina Ribeiro e João Carrola)
</figcaption>
</center>
<br>

  <p class='mainText'>Os ovos de peixe-zebra medem cerca de 0,6-0,7 mm de diâmetro e uma fêmea pode
produzir até 700 por postura</html><ref><html>SPENCE, R. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18093234/">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio</a></em>, <em>Biological reviews</em>, 83, 13-34. 2008.</html></ref><html>. Dependendo das condições ambientais, principalmente da temperatura e fotoperíodo, a eclosão dos ovos ocorre por volta do 2 dpf para a maioria dos
ovos, sendo que ao 3 dpf (FIGURA 6) a eclosão é finalizada</html><ref><html>RIBAS, L. & PIFERRER, F.,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/raq.12041">The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research</a></em>, <em>Reviews in Aquaculture</em>, 6, 209-240. 2014.</html></ref><html>.</p>

<br>
<figure class="image-big">
    <img src="https://rce.casadasciencias.org/static/images/articles/2022-021-06.jpg">
</figure>
<center>
<figcaption>FIGURA 6. Esquema representativo das várias fases do ciclo de vida do peixe-zebra. É possível estudar aspetos importantes
do desenvolvimento embrionário sem recorrer a técnicas invasivas pois o ovo desta espécie é transparente.
</figcaption>
</center>
<br>

<br>

  <p class='mainText'><strong>Desenvolvimento embrionário</strong></p>

  <p class='mainText'>O desenvolvimento embrionário do peixe-zebra começa com a formação do zigoto. O ovo permanece
nesta fase até 0,75 horas pós fertilização (hpf), momento em que ocorre a primeira
clivagem, que caracteriza o início do período de clivagem. Durante este período (0,75 às 2,25
hpf), ocorrem seis clivagens com intervalos de cerca de 15 minutos, e o organismo vai aumentando
o seu grau de celularização (2, 4, 8, 16, 32 e 64 células ou blastómeros). A partir da
fase de 128 blastómeros, o organismo entra no período de blástula, durante o qual se forma a
camada sincicial do vitelo e tem início a epibolia, que se estende até à gastrulação (5,25 hpf).</p>

  <p class='mainText'>No período de gástrula a epibolia continua, e ocorrem movimentos morfogenéticos das
células, que conduzem à formação das camadas germinativas primárias e do eixo embrionário.
Posteriormente, durante o período de segmentação, ocorre a diferenciação morfológica
das primeiras células e os primeiros movimentos do corpo. Durante este período também
se observa o aparecimento dos esboços primários dos órgãos e o desenvolvimento de
sómitos. Após a formação de 26 pares de sómitos (22 hpf), termina o período de segmentação
e começa o de faríngula, que se caracteriza pelo aparecimento de uma notocorda
bem desenvolvida, dos arcos faríngicos e das barbatanas peitorais, pelo desenvolvimento
do cérebro em 5 lobos distintos, circulação de sangue pelo corpo, entre outos. Este período
estende-se até às 42 hpf.</p>

  <p class='mainText'>Ulteriormente (72 hpf), ocorre a eclosão, durante o qual o embrião se liberta do córion,
dando início ao período larvar, no qual o peixe-zebra passa 4 semanas. Durante esta fase,
parâmetros como a temperatura, densidade e diferenças individuais, interferem com o desenvolvimento,
tornando-se mais difícil a padronização dos estágios larvares</html><ref><html>KIMMEL, C. B. <em>et al.</em>,
<em><a class="a-link" target="_blank"
                href="https://anatomypubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/aja.1002030302">Stages of embryonic development of the zebrafish</a></em>, <em>Developmental dynamics</em>, 203, 253-310. 1995.</html></ref><html>.</p>

  <p class='mainText'>A diferenciação do aparelho reprodutor ocorre mais tarde. Sendo esta uma espécie gonocórica
indiferenciada, as gónadas de todos os indivíduos, na fase inicial de maturação,
desenvolvem-se como ovários e, só 5 a 7 semanas após a eclosão começa a diferenciação
dos testículos em 50% dos indivíduos.</p>

<br>

  <p class='mainText'><strong>Considerações finais</strong></p>

  <p class='mainText'>Apesar de algumas limitações, existem numerosas vantagens associadas à utilização do
peixe-zebra (embriões e também animais adultos) como organismo modelo na avaliação
ecotoxicológica e também nas ciências biomédicas, para deteção de tóxicos na água, investigação
dos mecanismos de ação e efeitos em vários níveis biológicos) o que tem contribuído
de forma significativa para o interesse desta espécie bem patente no aumento do
número de publicações científicas internacionais.</p>

  <p class='mainText'>Por outro lado, o desenvolvimento de linhas transgénicas de peixe-zebra (por exemplo
proteínas fluorescentes) permite melhorar o sistema biológico, sendo uma ferramenta ainda
mais eficiente para os estudos de ecotoxicologia.</p>

  <p class='mainText'>O embrião de peixe-zebra oferece amplas opções para o uso como um organismo complexo
e substitui o uso de outros modelos animais como roedores, implementando o princípio
dos 3R’s e permite estimar o efeito de tóxicos para as espécies piscícolas nativas e até
extrapolar com muita cautela para outros vertebrados incluindo para os humanos quando
os mecanismos moleculares ou bioquímicos envolvidos estão bem conservados.</p>

  <p class='mainText'>Os poluentes emergentes, como compostos sintéticos industriais, pesticidas, produtos
farmacêuticos, medicamentos veterinários e humanos, plásticos, retardantes da chama,
substâncias psicoativas, cosméticos etc., são constantemente lançados nos ecossistemas
aquáticos e podem afetar a saúde dos animais selvagens, contaminar a água e os peixes,
o que pode afetar a saúde humana. É por isso importante monitorizar de forma eficiente,
sensível e económica estes compostos tóxicos e sempre que possível implementar medidas
legais para reduzir a sua produção e/ou entrada no ambiente para evitar a contaminação
da água (limitando os seus usos), dos solos, mas também das cadeias alimentares
fundamentais também para a qualidade de vida e saúde do Homem.</p>

</html>

=Referências=
<references/>
---- <br>Criada em 2 de Agosto de 2021<br> Revista em 18 de Janeiro de 2022<br>Aceite pelo editor em 15 de Junho de 2022<br>
[[Category:Biologia]]